Pt(IV)-conjugated drug-delivery system menunjukkan kemanjuran dalam terapi glioblastoma
Sebuah studi baru-baru ini yang diterbitkan dalam Journal of Controlled Release menunjukkan metode baru untuk memberikan obat anti-kanker yang terkonjugasi dengan peptida penembus sel yang dimodifikasi blood-brain barrier (BBB) pada tikus untuk mengobati glioblastoma (GBM).
Latar belakang
Seperti kebanyakan tumor, tumor otak berkembang karena proliferasi sel yang tidak normal; mereka bisa bersifat kanker atau non-kanker. Ada dua jenis tumor otak primer: glial (terdiri dari sel glial) dan non-glial (berkembang di dekat saraf, pembuluh darah, atau kelenjar). Glioma adalah tumor otak yang berasal dari sel glial. Glioblastoma (GBM) adalah yang paling umum, ganas (kanker), dan mematikan dari semua tumor glial; kebanyakan pasien GBM hidup hanya sekitar 15 bulan setelah diagnosis. Tingkat kelangsungan hidup 5 tahun GBM di bawah 5%.
Tantangan utama dalam mengobati kanker otak adalah kemampuan untuk mentransfer agen terapeutik melalui BBB – jaringan pembuluh darah dan sel yang melindungi otak dari zat berbahaya. Telah diamati bahwa obat-obatan pelawan kanker tidak mampu menembus BBB dalam jumlah yang efektif untuk terapi. Obat-obatan dengan khasiat anti-kanker yang terbukti tidak menunjukkan banyak efek pada hasil kanker otak, kemungkinan karena penetrasi BBB yang selektif.
Manajemen kanker standar melibatkan eksisi tumor bedah, diikuti dengan terapi radiasi dan kemoterapi temozolomide (TMZ). Pada tahun pertama setelah diagnosis, sebagian besar pasien akan mengalami kekambuhan tumor. Cisplatin umumnya digunakan untuk mengobati berbagai jenis tumor karena kemampuannya menghancurkan deoxyribonucleic acid (DNA) dengan ikatan silang antar atau intra untai.
Namun, cisplatin dan obat berbasis platinum lainnya dianggap tidak efektif untuk mengobati GBM karena tidak dapat menembus BBB. Karena alasan yang sama, obat anti kanker saat ini memberikan sedikit manfaat terapeutik bagi pasien GBM. Telah diusulkan bahwa meningkatkan penetrasi BBB dapat menjadi nilai yang sangat besar karena dapat memfasilitasi konsentrasi obat intra-tumoral yang lebih besar.
Dimungkinkan untuk meningkatkan jumlah obat yang dikirim ke GBM dengan menggunakan injeksi intraventrikular langsung dan obat implan, seperti wafer Gliadel, yang dapat langsung dimasukkan ke dalam rongga reseksi tumor segera setelah operasi.
BBB dapat dibuat permeabel secara sementara menggunakan larutan hiperosmotik atau ultrasonografi terarah. Atau, metode pengiriman sistem saraf pusat (SSP) non-invasif menjanjikan, dan beberapa modalitas seperti itu saat ini sedang menjalani uji praklinis. Di antaranya adalah nanopartikel yang menembus BBB, formulasi liposomal, dan sistem pengiriman berbasis peptida, misalnya cell-penetrating peptides (CPPs).
Peptida terkonjugasi dengan obat muncul sebagai agen terapi penting dalam mengobati berbagai penyakit, termasuk kanker. Peptida berkhasiat pada tumor otak karena peptida memiliki kemampuan bawaan untuk melintasi membran dan menembus jaringan.
Sebelumnya, para peneliti menciptakan M13 – turunan CPP Transportan 10 (TP10), yang disintesis dengan menambahkan perfluoroaryl macrocycle ke yang terakhir. Perubahan ini memungkinkan penetrasi yang lebih besar melalui spheroid BBB tiga dimensi in vitro dan menyebabkan akumulasi di otak tikus in vivo. Pt (IV)-M13 memfasilitasi transpor platinum ke dalam jaringan otak tikus sehat, mengikuti konjugasi ke cis,cis,trans-[Pt (NH3)2Cl2(OH)2], bentuk prodrug Pt(IV) dari cisplatin.
Platinum mudah dideteksi dengan inductively-coupled plasma mass spectrometry (ICP-MS) – sebuah teknologi yang dapat mengukur kadar logam yang sangat kecil dalam jaringan biologis.
Tentang studi
Dalam studi saat ini, para peneliti memeriksa pengangkutan platinum dengan kombinasi Pt(IV)-M13 dalam model BBB-spheroid, in vitro, serta otak sehat dan tumor model GBM-xenograft tikus.
Di sini, persiapan dan karakterisasi awal peptida terkonjugasi obat [Pt(IV)-M13] dilakukan. Sitotoksisitas Pt(IV) dievaluasi dengan membandingkan efeknya pada lini sel GBM yang dikultur sebagai neurosfer dengan Pt(IV) tanpa konjugasi dan cisplatin. Model spheroid BBB tiga dimensi yang mensimulasikan BBB digunakan untuk menganalisis, in vitro, penetrasi obat dan peptida di seluruh BBB.
Analisis kuantitatif dari jumlah platinum pada tikus yang mengandung tumor GBM dilakukan menggunakan ICP-MS untuk menentukan sifat penembusan dan biodistribusi platinum.
Konjugat Pt(IV)-M13 diberikan pada tikus telanjang yang mengandung tumor untuk memeriksa farmakokinetik akumulasi platinum di otak yang sehat dan jaringan tumor. Analisis ICP-MS jaringan otak dan jaringan tumor dilakukan dari waktu ke waktu. Jadwal dosis referensi konstan 5 mg / kg cisplatin dipilih untuk mengevaluasi farmakologi peptida terkonjugasi obat.
Peptida terkonjugasi obat dianalisis menggunakan mikroskop imunofluoresensi confocal untuk mendeteksi penanda kerusakan DNA - γH2AX. Pemberian prodrug Pt(IV) bersamaan dengan cisplatin dilakukan pada dosis maksimum yang dapat ditoleransi (MTD) 5 mg/kg – dengan peningkatan dosis.
Menggunakan jadwal pengobatan empat minggu dengan dosis awal 5-30 mg peptida terkonjugasi obat, efek pada dosis toleransi tertinggi (15 mg/kg, dua kali seminggu) pada pertumbuhan tumor pada model hewan GBM dievaluasi. Peneliti melakukan studi MRI selama terapi (20 hari setelah implantasi tumor) untuk membandingkan perilaku pertumbuhan tumor antar kelompok saat kelompok kontrol mulai mencapai target pertumbuhan yang telah ditentukan.
Temuan
Ditemukan bahwa bila dibandingkan dengan Pt(IV) saja, konjugasi prodrug Pt(IV) ke peptida M13 secara signifikan meningkatkan sitotoksisitas Pt(IV) dan menurunkan pertumbuhan neurosfer pada garis sel GBM. Itu ditunjukkan secara in vitro bahwa peptida terkonjugasi obat membunuh sel GBM secara efektif.
The Pt(IV)-M13 peptide-drug conjugate exerts cytotoxic effects in vitro. a) Chemical structures of the tested platinum compounds: 1) cisplatin, 2) Pt(IV) prodrug and 3) the Pt(IV)-M13 peptide conjugate. b) Cell viability of GBM cell lines treated in the presence of cisplatin, Pt(IV) and Pt(IV)-M13 for 4 days. Concentrations shown in μM. Results are shown as relative values to non-treated controls. Cell viability was measured using the CellTiter-Glo 3D assay. Each point represents mean and standard deviation at the indicated concentration. c) Bar chart of IC50 values for each cell type upon cisplatin, Pt(IV) prodrug and Pt(IV)-M13 treatment. Mean and standard deviation, n = 3. d) Growth-in-low attachment (GILA) assay for assessing G9-pCDH and G34-pCDH neurosphere formation in the presence of Pt(IV)-M13, Pt(IV) prodrug or cisplatin. GFP channel (488 nm) was used for image acquisition at day 4 after compound addition. e) and f) Percentage of sphere area quantification relative to non-treated control from assays in d) G9-pCDH cells and G34-pCDH cells. All experimental data are presented in triplicates. Sidak's multiple comparison test * p-value<0.05, ** p-value<0.01, *** p-value<0.001, **** p-value<0.0001.
Selanjutnya, penyerapan platinum terbatas pada spheroid BBB yang diobati dengan prodrug cisplatin atau Pt(IV) saja. Namun, penyerapan platinum meningkat pada model spheroid BBB ketika prodrug Pt(IV) dikonjugasikan dengan peptida M13. Ini menyiratkan bahwa peptida terkonjugasi-obat secara efisien memindahkan spheroid BBB.
Pt(IV)-M13 is internalized into BBB spheroids in an energy-dependent manner. a) Experimental workflow for the BBB spheroid incubation with platinum compounds (Pt(IV)-M13, Pt(IV) prodrug or cisplatin) for ICP-MS analysis for platinum quantification and incubation at 37 °C or 4 °C for uptake mechanism studies. Figures were generated in Biorender.com. b) Platinum (195Pt) quantification via ICP-MS. Each compound was added at the indicated concentration for 3 h into BBB spheroids. c) Intracellular platinum content quantification from BBB spheroids treated with either 1 μM of Pt(IV)-M13 or cisplatin and incubated for 3 h at the indicated temperatures. Mean and SD are shown from triplicates. d) Dextran permeability in BBB spheroids. TRITC-labelled dextran (155 kDa, red) was co-incubated for 3 h with BBB spheroids treated with each compound and visualized under confocal microscopy at 85 μm depth (within blue circle). Image is a representative picture of a triplicate of photos. Scale bar = 50 μm. e) Mean fluorescent quantification of TRITC-dextran permeability shown within the blue circle of d). For b), c) and e) mean and SD are shown from triplicates, two-way ANOVA test. Significance at *p < 0.05, ***p < 0.001, ****p < 0.0001. (For interpretation of the references to colour in this figure legend, the reader is referred to the web version of this article.)
Perawatan peptida terkonjugasi dengan obat secara signifikan meningkatkan serapan platinum dibandingkan dengan cisplatin pada jaringan otak yang sehat dan delapan kali lipat pada jaringan tumor. Menurut penelitian ini, konjugasi M13 ke prodrug Pt(IV) menghasilkan peningkatan serapan platinum di BBB dan peningkatan konsentrasi platinum di otak dan tumor. Sementara itu, paru-paru dan ginjal, tempat utama akumulasi obat platinum, tidak menunjukkan perbedaan yang signifikan.
Lima jam setelah injeksi peptida terkonjugasi obat Pt(IV)-M13, akumulasi platinum di otak dan jaringan yang sehat mencapai maksimum. Tidak ada penambahan berat badan yang signifikan yang dikaitkan dengan pemberian peptida terkonjugasi obat. Data juga menemukan bahwa mencit mentolerir peningkatan dosis Pt(IV)-M13 dengan baik.
Selanjutnya, baik dosis maupun titik waktu tidak menunjukkan perbedaan yang signifikan, menunjukkan bahwa dosis ini aman untuk tikus telanjang dan sesuai untuk studi kelangsungan hidup eksplorasi.
Platinum biodistribution and uptake kinetics after Pt(IV)-M13 administration in a GBM xenograft murine model. a) Scheme of experimental approach for G30-LRP tumor implantation in naïve nude mice, tail-vein administration of platinum compounds and organ collection for platinum quantification by ICP-MS (195Pt). b) Platinum levels in different organs after 5 h of treatment with 1.5 mg/kg of either Pt(IV)-M13 or cisplatin. Brain and tumor levels are shown separately to highlight platinum uptake by Pt(IV)-M13 in brain and tumor tissue above cisplatin; n = 3–4 mice/group. c) Fold-change of Pt(IV)-M13/cisplatin from experiment shown in b). Mean and standard deviation are shown, n = 3. d) Platinum distribution kinetics in brain and GBM tumor after administration of 1.5 mg/kg of Pt(IV)-M13 via tail-vein. Mean and standard deviation are shown, n = 4. Statistical analysis for b) and d) involved two-way ANOVA test. *p < 0.05, ****p < 0.0001. Statistical analysis for c) involved one-way ANOVA test, **p < 0.005, ***p < 0.0005. d) did not show any significant differences among groups.
Ditemukan juga bahwa peningkatan kadar platinum, bila dikombinasikan dengan pengobatan Pt(IV)-M13, meningkatkan kerusakan DNA pada tumor, yang diyakini berkontribusi pada peningkatan kelangsungan hidup yang teramati. Para penulis menunjukkan, untuk pertama kalinya, bahwa menggabungkan prodrug cisplatin (Pt(IV)) ke peptida penembus sel makrosiklik (M13) efektif.
Dose-regime and efficacy studies of Pt(IV)-M13 reveal DNA-damage effects on GBM tumors. a) Percentage of weight variation of naïve nude mice administered after platinum compound tail-vein injection at the indicated concentrations. Black arrows indicate days of injection (d1, d4, d9, d13, d17, d19). Mean and standard deviation are shown, n = 5 animals per group. b) Average clinical score from study shown in a). Mice were monitored every 2 days for symptomatic changes. Symptoms were classified from no symptoms (0), visible (2), to fatal (4). Eye redness, eye twitching and weight loss were the most visible effects. c) Efficacy study of Pt(IV)-M13 (5 mg/kg, 0.3 mM) compared to cisplatin MTD (5 mg/kg, 3 mM). d) Immunostaining of ϒH2AX (Ser139) using anti-rabbit Alexa Fluor 647, and nuclei with Hoechst 33342. Representative image of independent tissue triplicates from the efficacy study c). Scale bar, 10 μm. e) Area percentage of positive cells with ϒH2AX foci within the tumor core from study in d). Statistical significance for c) using log-rank test, *p = 0.020. Median survival for each group is shown. For e), mean and standard deviation are shown, n = 3. Two-way ANOVA test **p < 0.005, ***p = 0.0004.
Hasil ini menunjukkan bahwa konjugasi cisplatin dengan peptida penembus sel makrosiklik (M13) memungkinkan pemberian dosis yang efektif pada tikus – pada MTD tiga kali lebih tinggi daripada cisplatin saja, dengan demikian, memberikan keuntungan kelangsungan hidup yang signifikan.
Maximum tolerated dose studies (MTD) of the Pt(IV)-M13 peptide conjugate. a) Scheme of dose regime studies of Pt(IV)-M13 in nude naïve mice. Injection days are indicated along with dosages of the unconjugated Pt(IV) prodrug and Pt(IV)-M13 for each week. Figure was generated in Biorender.com. b) Percentage of weight variation upon platinum compound administration. Black arrows indicate day of administration and at the concentration shown for each week (week 1: d1 and d4, week 2: d7 and d11, week 3: d14 and d18, week 4: d21 and d24). Black dotted line represents 100% basal weight. Cisplatin remained constant at its MTD dose of 5 mg/kg (n = 5 mice per group). Mean and standard deviation are shown. c) Average clinical score per group from study in b). Mice were monitored every 2 days for symptomatology changes. Symptoms were classified in from no symptoms (0) to severe to fatal (4). Eye redness, eye twitching and weight loss (scores 2–3) were the most visible effects. The study was halted when the cisplatin and Pt(IV)-M13 groups started showing visible symptoms. Mean and standard deviation are shown, n = 5.
High doses of Pt(IV)-M13 improve GBM tumor-bearing mice survival and increase platinum intra-tumoral and brain uptake. a) Scheme of G30-LRP tumor implantation in naïve nude mice and subsequent treatment with each platinum compound for efficacy studies and platinum level quantification. Figure was generated in Biorender.com. b) Kaplan-Meier curve of tumor-bearing mice. Compound administration started at day 10 using a bi-weekly regime. Doses of 5 mg/kg cisplatin (3 mM), 15 mg/kg Pt(IV) (5 mM) and 15 mg/kg Pt(IV)-M13 (0.9 mM). c) Representative T2w MRI of a single mouse of each treatment arm at day 20 post-tumor implantation. Blue contours indicate tumor location. d) ICP-MS quantification of platinum in tumor and healthy brain tissues from efficacy study b). For b) median survival is shown, n = 6 mice per group, using log-rank test, p = 0.01. For c) and d), statistical significance was shown as mean and standard deviation, n = 3. Two-way ANOVA test, *p < 0.05, **p = 0.0035, ***p < 0.0001. (For interpretation of the references to colour in this figure legend, the reader is referred to the web version of this article.)
Kesimpulan
Hasilnya menjelaskan bahwa injeksi sistemik dari kompleks Pt(IV) yang terkonjugasi ke peptida makrosiklik penetran otak dapat menonjolkan tingkat platinum otak dan memperpanjang kelangsungan hidup pada model GBM tikus.
CPP berstapler makrosiklik perfluoroaril menunjukkan hasil yang menjanjikan bila digunakan sebagai sarana pengiriman obat untuk pengobatan tumor otak trans-BBB. Selanjutnya, Pt (IV) -M13 adalah strategi yang menjanjikan untuk pengiriman sistemik kemoterapi GBM ke otak, yang mengatasi tantangan yang ditimbulkan oleh BBB, yang saat ini menghambat sebagian besar terapi onkologi.
Journal reference:
Jimenez-Macias, J. L., Lee, Y.-C., Miller, E., et al. (2022). A pt(iv)-conjugated brain penetrant macrocyclic peptide shows pre-clinical efficacy in glioblastoma. Journal of Controlled Release. doi: 10.1016/j.jconrel.2022.10.051 https://www.sciencedirect.com/science/article/abs/pii/S0168365922007295
No comments