Studi menyimpulkan virus monkeypox mudah dideteksi oleh qPCR menggunakan tiga tes yang divalidasi secara klinis

Read Also

Dalam sebuah penelitian baru-baru ini yang diposting ke medRxiv*, para peneliti memvalidasi monkeypox virus (MPXV) quantitative polymerase chain reaction (qPCR).

Latar belakang

Kasus human monkeypox (MPX) jarang terdeteksi di luar negara endemik MPXV sejak ditemukan pada tahun 1970-an. Penyakit zoonosis ini telah diabaikan hingga wabah yang sedang berlangsung, meskipun ada peringatan penyebaran global dan bukti peningkatan penularan dari manusia ke manusia. Lebih dari 77.000 kasus MPX telah dilaporkan dari lebih dari 100 negara dalam wabah MPX yang sedang berlangsung.

Kasus MPX dapat disertai dengan demam, limfadenopati, dan ruam papiler. Subyek immunocompromised beresiko manifestasi MPX parah, termasuk kematian. Obat antivirus, tecovirimat (Tpoxx), dan vaksin JYNNEOS yang awalnya dikembangkan untuk cacar adalah satu-satunya penanggulangan terhadap MPX. Karena deteksi virus dini dan cepat diperlukan untuk pencegahan dan pengobatan MPX, mengembangkan uji qPCR sangat penting untuk mengganggu jaringan transmisi.

Studi dan temuan

Dalam penelitian ini, para peneliti mengevaluasi dua uji qPCR spesifik MPXV yang menargetkan lokus G2R dan F3L dan membandingkan sensitivitas, spesifisitas, dan akurasinya dengan uji pan-orthopoxvirus Disease Control and Prevention’s (CDC) (OPXV-E9L). Para penulis secara komersial memperoleh DNA MPXV sintetik (VR-3270SD) karena pasokan sampel klinis MPXV dan DNA genomik yang terbatas pada musim semi 2022.

Templat yang dibeli (VR-3270SD) memiliki tempat pengikatan untuk primer dan probe untuk banyak pengujian yang dikembangkan sebelumnya. Para peneliti memperkirakan jumlah salinan yang tepat dari standar ini dengan droplet digital PCR (ddPCR) menjadi 1,29 x 108 salinan/ml untuk lokus MPXV-F3L dan OPXV-E9L dan 1,3 x 108 salinan/ml untuk lokus MPXV-G2R.

Para penulis menguji 15 virus herpes simplex (HSV)-positif, 17 virus varicella-zoster (VZV)-positif, dan 52 sampel swab kulit HSV/VZV-negatif menggunakan uji OPXV-E9L dan memverifikasi bahwa mereka negatif untuk MPXV. Uji F3L tidak mendeteksi DNA MPXV pada spesimen ini, sedangkan pada uji G2R, satu sampel positif VZV ditemukan positif untuk G2R tetapi diuji negatif G2R secara berulang.

Tes G2R dan F3L memiliki persetujuan persen negatif masing-masing 98,8% dan 100%, di 84 sampel. Selanjutnya, tim menguji reaktivitas silang tes MPXV dengan virus camelpox (CMLV), cowpox (CPXV), dan vaccinia (VACV), yang merupakan kerabat dekat filogenetik dari MPXV. Uji MPXV-F3L dan -G2R tidak mendeteksi DNA CMLV, CPXV, dan VACV, sedangkan uji OPXV-E9L menunjukkan nilai ambang Cycle threshold (Ct) masing-masing sebesar 19,8, 25,8, dan 23,8.

Kemampuan untuk mendeteksi DNA MPXV dinilai dengan menggunakan contrived positives. Kesepakatan persen positif adalah 100% untuk uji OPXV-E9L dan 99,1% untuk uji MPXV-G2R dan -F3L. Selanjutnya, mereka menguji apakah tes G2R dan F3L akan secara akurat mendeteksi MPXV dalam sampel (klinis) dan mengamankan tujuh spesimen swab kulit positif MPXV dari public health laboratory (PHL).

Spesimen PHL diencerkan 1:40 sebelum ekstraksi karena kendala volume. Dua puluh spesimen klinis MPXV yang dites positif pada uji F3L secara bersamaan diuji dengan uji OPXV-E9L dan MPXV-G2R. Uji spesifik MPXV rata-rata memiliki nilai Ct yang lebih rendah daripada uji OPXV-E9L untuk setiap spesimen. Selain itu, uji G2R memiliki Ct yang lebih rendah daripada uji F3L di setiap sampel, konsisten dengan dua salinan G2R dalam genom MPXV.

Para peneliti memperkirakan limit of detection (LoD) menjadi 330 salinan/ml, setara dengan 3,3 salinan per reaksi (PCR) menggunakan metode ekstraksi standar untuk pengujian MPXV-F3L dan -G2R. Mereka juga memvalidasi uji MPXV-F3L menggunakan jenis spesimen yang berbeda, seperti cairan serebrospinal, urin, serum, plasma, darah lengkap, dan swab oral/rektal/nasofaring/vagina.

Kesepakatan persen negatif adalah 100% untuk semua jenis spesimen. Persen persetujuan positif adalah 100% untuk apusan nasofaring/rekta/vagina, plasma, cairan serebrospinal, darah utuh, dan ASI, 95,7% untuk sampel urin, dan 95,5% untuk sampel serum. LoD untuk sampel ini diperkirakan 1000 kopi/ml (10 kopi/ml per reaksi).

Menggunakan spesimen klinis MPXV, persetujuan persen negatif adalah 100% untuk air liur, air mani, dan penyeka rektal/oral/kering. Persen persetujuan positif adalah 100% untuk air liur, penyeka dubur, dan air mani dan 95% untuk penyeka oral/kering. LoD untuk uji F3L adalah 260 kopi/ml untuk air mani, 780 kopi/ml untuk air liur, swab rektal dan oral, dan 810 kopi/swab untuk swab kering.

Kesimpulan

Singkatnya, penelitian ini menilai sensitivitas dan spesifisitas dari set primer dan probe spesifik MPXV bersama dengan uji pan-orthopoxvirus. LoD untuk pengujian ini serendah 3,3 salinan per reaksi (PCR) dengan mengekstraksi hingga spesimen 250 μl. Tidak ada pengujian yang menunjukkan reaktivitas silang dengan VZV atau HSV, yang menunjukkan spesifisitas tinggi.

Secara keseluruhan, kinerja ketiga pengujian untuk deteksi MPXV sebanding, dengan masing-masing sangat sensitif untuk DNA MPXV. Uji MPXV-F3L memiliki spesifisitas tinggi untuk MPXV dan tidak bereaksi silang dengan HSV atau orthopoxvirus lain dan akan menjadi alat penting untuk mengurangi transmisi MPXV dalam wabah yang sedang berlangsung.

*Pemberitahuan Penting

medRxiv menerbitkan laporan ilmiah awal yang tidak ditinjau sejawat dan, oleh karena itu, tidak boleh dianggap sebagai konklusif, memandu praktik klinis/perilaku yang berhubungan dengan kesehatan, atau diperlakukan sebagai informasi yang mapan.

Journal reference:

Mills, M. et al. (2022) "Evaluation and Clinical Validation of Monkeypox Virus Real-Time PCR Assays". medRxiv. doi: 10.1101/2022.11.12.22282254. https://www.medrxiv.org/content/10.1101/2022.11.12.22282254v1